PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)

중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 캐리 멀리스(Kary B. Mullis)에 의하여 1985년에 개발되어 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사법으로, 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법입니다. 중합효소 연쇄 반응에 의해, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있으므로, 인간의 DNA를 증폭하여 여러 종류의 유전질환을 진단하는 데 사용됩니다. 또한 세균이나 바이러스, 진균의 DNA에 적용하여 감염성 질환의 진단 등에 사용할 수 있습니다.

 

중합효소 연쇄 반응의 순서는 3단계로 이루어집니다. [그림1] 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하는 열변성 과정(denaturation)을 거친 후, 온도를 낮추어 시발체(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)하게 하고, 다시 열을 약간 올려서 DNA를 합성하는 중합 반응(polymerization or extension)을 일으킵니다. 열변성 과정은 보통 95℃에서 열을 이용하여 2가닥의 DNA의 상보적인 염기의 수소결합을 1가닥으로 떨어뜨리는 과정이며, 결합 반응은 약 55~65℃에서 한 가닥의 DNA에 시발체가 상보적인 염기서열에 결합하는 과정입니다. 마지막으로 중합 반응은 한 가닥의 DNA(주형 DNA)에 시발체가 붙은 다음의 염기에 DNA 중합효소(polymerase)를 이용하여 주형 DNA의 상보적인 염기를 합성하여 두 가닥의 DNA으로 연장시킵니다.

 

단계1. DNA의 변성 (Denaturation)

이 단계는 90°C∼96°C 온도로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킵니다. 높은 온도일수록 single strand DNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓰며, Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5~10분정도 시간으로 반응을 해야 합니다.

 

단계2. Primer의 결합 (Annealing)

Primer 가 결합되는 annealing 단계는 50°C∼65°C 온도에서 진행됩니다. 염기간에 G와 C는 3개의 수소결합이 일어나고, A와 T는 2개의 수소결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 합니다. 만약 비특이적인 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 될 수가 있습니다.

 

단계3. DNA의 합성 (Polymerization)

DNA 가 합성되는 polymerization 단계에서는 70°C∼74°C 온도에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋습니다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있습니다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 하면 됩니다.

그 후 다시 열변성 과정, 결합 반응, 중합 반응을 반복하여 DNA를 증폭하게 됩니다.

 

 

[그림2] 중합효소 연쇄 반응 1회를 시행하면 유전 물질은 2배로 증폭됩니다. 따라서 반응의 반복에 의한 기하급수적인 증폭이 가능하고, 중합효소 연쇄 반응을 n회를 반복하면 이론상으로 2의 n승배의 유전자가 증폭됩니다.