1. SNP 정의

SNP 란 Single Nucleotide Polymorphism에 약어로써, 염색체의 단일 부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이로 인간의 게놈에는 약 3백만개의 SNP가 존재하여 약 500~1,000염기당 1개꼴로 나타난다. 그 중에 약 20만개가 단백질을 만드는 유전자에 존재한다고 추정한다.   

SNP는 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 즉 DNA사슬의 특정부위에 어떤 사람은 아데닌(adenine; A)을 가지고 있는 반면 어떤 사람은 시토신(cytosine; C)을 가지고 있는 것이다. 이런 미세한 차이(SNP)에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 사람을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다.    전 세계적으로 SNP 개발 및 연구가 활발히 진행 중이며, 이를 이용하여 각 주요 질병에 대한 상관관계를 증명하기 위한 연구 활동이 이루어지고 있다.

 

2. SNP 분석 방법

SNP 분석에는 다양한 방법이 이용되고 있다. 지금까지 개발되고 이용중인 대부분의 방법은 PCR 방법에 기초하여 여러 시료에 대한 한정된 수의 SNP 분석이 주를 이루고 있으나 DNA array를 이용하여 하나의 시료에 대한 여러 SNP를 동시에 분석할 수 있는 방법도 개발되고 있다.

(1) PCR을 이용한 기존방식

1) SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

실제로 SNP 발굴에 많이 이용되는 방법으로 PCR로 해당 부위를 증폭한 뒤 이중나선 DNA를 높은 온도 조건(95℃)에서 변성(denature)시켜 단일가닥으로 만든 뒤 빠르게 냉각시켜 단일 가닥 염기서열 특유의 입체 구조를 형성하게 한다. 이를 denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동을 수행하면 염기서열 상의 차이가 존재하는 각각의 single strand는 서로 다른 이동상을 가지게 된다. 따라서 길이가 같더라도 그 안에 서로 다른 염기 구조를 가지게 되면 이동 상에서 구별이 되므로 sample사이의 이동속도를 비교하여 변이를 확인 할 수 있다. SSCP 분석에는 보통 denaturing polyacrylamide gel 전기영동 후 isotope, sliver staining 등으로 검출하는 방법이 이용되어 왔다. 최근에는 PCR Primer에 형광 dye를 합성하여 automatic sequencer로 분석하는 방법이 이용되고 있다.’

2) AFLP(Amplified Fragment Length Polymorhism)

인식부위가 많지 않은 특정 제한효소로 절단된 DNA의 단편들에 adaptor(합성한 DNA조각)를 붙인 다음, adaptor의 염기서열을 바탕으로 제작된 primer를 사용하여 각 단편들을 증폭시켜 얻어지는 band pattern의 차이를 비교하는 것이다. AFLP는 RFLP로 탐지하기 어려운 유전체내 제한효소 인식부위 변이를 보다 더 용이하게 탐지할 수 있고 RAPD보다 고감도로 PCR 산물을 얻을 수 있다. 여러 개의 유전자 자위를 동시에 동정하는 것이 가능하며, 다형성(polymorphism)이 드문 계통에 적용 할 수 있을 뿐 아니라 양 말단의 DNA 염기서열을 알지 못하는 제한효소 단편을 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다.

3) RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP는 제한효소(restriction enzyme) 처리에 의한 DNA 단편 조각의 길이 차이를 확인하여 SNP를 typing하는 방법이다. 즉 PCR을 통해 증폭된 DNA fragment를 SNP 부위가 특정 제한효소에 의하여 구별될 수 있는 경우에 이용된다. 증폭된 DNA fragment의 SNP에 의하여 특정 제한효소에 대한 restriction site의 염기서열이 달라져 두 SNP allele의 fragment 길이의 차이가 발생하여 agarose gel 상에서 전기영동을 통해 쉽게 확인 할 수 있다. 많은 종류의 제한효소가 시판되고 있고 원하는 염기서열에 작용하는 인식부위를 찾아주는 software가 web상에서 무료로 제공되고 있어 손 쉽게 이용할 수 있다. 하지만 30~40%의 SNP는 restriction site를 가지고 있지 않은데 이를 해결하기 위해서 primer 상에 1~2bp의 변화를 주어 실재하지 않는 restriction site를 만들어 typing에 이용하기도 한다.

PCR을 통해 Genotyping 수행하는 방법에는 이 밖에도 많이 존재한다

 

(2) 대용량 SNP Genotyping 방식

PCR의 Platform은 현재 일반적으로 96well 또는 384well을 기반으로 장비가 시장에 공급되고 있다. 그러나 대량의 시료를 일반적인 PCR장비를 통해 Genotyping을 수행한다면 엄청난 시간과 인력, 시약이 요구된다. 이와 같은 문제를 해결하고자 효율적인 Genotyping을 위한 장비 및 방법을 소개한다.

<효율적인 대용량 Genotyping을 위한 장비, Biomark HD>

Biomark HD 장비는 샌프란시스코에 본사를 두고 있는 Fluidigm 사에서 공급하는 장비이다. Fluidigm 사는 핵심 기술인 나노플렉스 밸브를 이용하여 나노 단위의 용액의 이동을 정밀하게 조절하는 Integrated Fluidic Circuits (IFC) 칩을 기반으로, 유전자 발현 분석, SNP genotyping, NGS library prep, 자동 세포 배양 등의 다양한 응용 분야에 이용되는 다양한 기기들을 보유하고 있다.   

1) Biomark HD 소개

대용량 유전자 발현 분석을 위한 PCR / Real-time PCR 장비로써, 1번 구동 시 최대 9,216 PCR 반응이 가능하다

<Biomark HD>

< IFC Chip >

 

2) IFC와 기존 96well plate의 차이점

9,216 PCR 반응을 위해서는 96well plate x 96회 or 384well plate x 24회 구동

   

3) Biomark HD의 장점

높은 생산성

짧은 실험 시간

비용 절감

단일세포 수준의 민감도